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    • 专利摘要:
    本發明係關於利用肺腺癌中高度的對偶基因失落（LOH）圖譜以發現高頻率基因內LOH及異生性淋巴瘤激酶不同區域中之不同突變型所導致異體移植老鼠腫瘤生長被強化之情形。異生性淋巴瘤激酶之突變型（H694R及E1384K突變型）加強第1604位置酪胺酸之磷酸化並活化異生性淋巴瘤激酶及其下游之Akt、STAT3及ERK致癌訊號傳遞途徑。在異體移植的老鼠體內，致癌訊號之增加導致強化了細胞增生、細胞群落形成、細胞遷移以及腫瘤的生長。利用西方墨點法及免疫組織化學染色分析，透過抗體偵測11株肺癌細胞株及263個癌組織樣本中第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶，證實不論處於何種癌症時期，所有的肺癌中之異生性淋巴瘤激酶均被活化。以異生性淋巴瘤激酶抑制劑WHI-P154治療突變鼠能導致腫瘤萎縮、抑制轉移並增進存活。異生性淋巴瘤激酶位於胺基酸序列第1604位置之酪胺酸被高度磷酸化會導致提早且持續性地使腫瘤惡化，而異生性淋巴瘤激酶位於胺基酸序列第1604位置之酪胺酸被高度磷酸化能作為用於檢測肺癌之生物指標。致癌化之點突變的異生性淋巴瘤激酶能做為治療肺癌之標的。
    公开号:TW201300781A
    申请号:TW100141496
    申请日:2011-11-14
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Yuh-Shan Jou；yi-wei Wang
    申请人:Academia Sinica；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    磷酸化之異生性淋巴瘤激酶及異生性淋巴瘤激酶之突變型作為診斷及治療肺炎的標的
    本發明係關於自肺腺癌患者發現新穎之異生性淋巴瘤激酶突變型及以一系列分析方法檢測各種致癌相關之活性，特別係關於以抑制劑透過抑制異生性淋巴瘤激酶突變型調控之致癌機轉達到治療肺癌之功效。
    肺癌是全世界每年有1百30萬的人口喪命的主因，可廣泛地分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancers,NSCLC)及小細胞肺癌(small cell lung cancers,SCLC)，並經WHO統計分別占有85%及15%之比例。在NSNCL中，具有腺癌(adenocarcinoma)之患者超過50%，並且近數十年來逐漸攀升，進而也取代了上皮細胞癌(squamous cell carcinoma)成為肺癌主要的亞型(subtype)。近來肺癌在分子基因研究中發現，肺癌細胞具有體細胞變異(somatic alteration)的常見基因包括p53、K-ras(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)、EGFR(epidermal growth factor receptor)、HER2(V-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2/ErbB-2)、c-MET(mesenchymal-epithelial transition factor)、LKB1(STK11/serine threonine-protein kinase 11)、PIK3CA(Phosphoinositide-3-kinase catalytic subunit)及BRAF(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)可誘發癌細胞選擇性優勢促使腫瘤生長、細胞凋亡之抑制、血管新生(angiogenesis)及腫瘤轉移。但只有EGFR突變型是做為肺癌治療的一種有指望的標的。EGFR突變型被視為是對肺癌治療之小分子EGFR酪胺酸激酶抑制劑如吉非普尼(gefitinib)及埃羅替尼(erlotinib)具有成效的重要標的。然而，對於在肺癌預後的影響上EGFR突變型作為治療標的仍具有爭議性。而肺癌之五年存活率整體而言約15%。因此，發現肺癌的新治療標的是為急迫需要的。在本發明之研究中指出，從肺腺癌患者體內發現6個新的異生性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,簡稱ALK)基因突變型，並透過一系列的分析方法檢測被高度強化的致癌活性。其中兩個致癌突變型H694R及E1384K係用以證實突變使ALK下游的致癌訊號具強的活性。更重要的是，突變型所調控的致癌性能藉由ALK抑制劑抑制，這說明了，帶有ALK突變之肺癌患者能夠藉由ALK抑制劑進行治療，是為一種新的增進患者存活率的治療方法。
    由於肺癌係為全世界癌症患者致死之首，因此發掘做為早期檢測肺癌的一種新的生物標記是重要的。本發明驗證，無論處於肺癌何種時期及衍生之亞型(subtype)，胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶(以下簡稱為Y1604磷酸化之ALK(phosphorylated-Y1604 ALK))表現普遍均有調升的現象。肺癌之Y1604磷酸化之ALK的高專一性及靈敏度可作為肺癌早期的診斷標記。本發明也針對ALK突變型調控的致癌性，提供抑制劑來治療肺癌。 相較習知技術本發明之技術特徵及優勢
    就算是以高療效之小分子EGFR酪胺酸激酶抑制劑如gefitinib及erlotinib投藥於具有EGFR突變型之肺癌患者，肺癌患者預後之五年的總體存活率仍約為15%。而針對具有潛在致癌活性之ALK突變，本發明之實驗結果證實藉由單一治療(monotherapy)或與其他突變標的如EGFR合併治療(combination therapy)，ALK基因可成為一有指望的標的，用於治療人類最普遍及高致死率之肺癌。
    為增進肺癌之存活率，開發一種新的診斷標記以用於肺癌的早期檢測是重要的。根據本發明之實驗結果，證明用於檢測肺癌的發生，檢測Y1604磷酸化之ALK表現上升是一個好的選擇。這是因為，在正常的肺部組織中Y1604磷酸化之ALK的平均計分強度為0.554±0.3340；相反的，在肺癌組織中，Y1604磷酸化之ALK的平均計分強度是戲劇性地上升至2.9684±0.6852。另外，也統計肺癌組織中的Y1604磷酸化之ALK之靈敏度及專一性。當免疫組織染色(IHC)強度大於2時，檢測肺癌之Y1604磷酸化ALK抗體之靈敏度及專一性係分別為92.8%及100%。而若設定IHC計分強度大於1，則Y1604磷酸化的ALK蛋白抗體之靈敏度及專一性係分別為99.6%及89.2%。更為重要的是，由於IHC分析方法係為在所有醫院中的常規流程，因此檢測Y1604磷酸化之ALK在臨床檢測肺癌上是一種便利又有效的方法。 本發明之商業化應用
    (I). ALK突變可作為單一治療或結合其他治療方法臨床干預手段的診斷及治療標的。同時也能於治療肺癌時所使用新的ALK抑制劑的有效標的。
    (II).　藉由IHC偵測調升的Y1604磷酸化之ALK表現量係能應用於偵測發生任何亞型之肺癌發生之早期或所有時期。
    肺癌是造成全世界每年有1百30萬的人口因此而喪命的主因，可廣泛地分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancers,NSCLC)及小細胞肺癌(small cell lung cancers,SCLC)，並經WHO統計分別占有85%及15%之比例。在NSNCL中，發展成腺癌之患者超過50%，並且近數十年來逐漸攀升，進而也取代了上皮細胞癌(squamous cell carcinoma)成為肺癌主要的亞型。近來肺癌在分子基因研究中發現，肺癌細胞具有體細胞變異(somatic alteration)的常見基因包括p53、K-ras、EGFR、HER2、c-MET、LKB1、PIK3CA及BRAF可誘發癌細胞選擇性的優勢促使腫瘤生長、細胞凋亡之抑制、血管新生(angiogenesis)及腫瘤轉移(metastasis)。隨著腫瘤之亞型、民族、抽菸習慣及性別之不同，EGFR突變型(佔小於40%)根據觀察主要係存在於亞洲女性不抽菸的腺癌患者中，而少部分係發生於非亞洲患者中。相反地，K-ras(佔小於30%)及LKB1(佔小於34%)突變則主要被檢測出存在於非亞洲族群的非吸菸患者中，而少數存在於亞洲族群的患者中。EGFR突變型被視為是一個對於小分子的EGFR酪胺酸激酶抑制劑如吉非普尼(gefitinib)及埃羅替尼(erlotinib)具有成效的重要標的。然而，對於在肺癌預後的影響上EGFR突變型作為治療標的仍具有爭議性。即使是最新的治療趨勢，但五年內之肺癌總體存活率仍約為15%。因此，在開發治療方法上，發現肺癌的新的治療標的是為急迫需要的。
    ALK最初被發現存在於另一染色體易位中(chromosomal translocation)t(2;5)(p23;q35)，這與約75%異位性大細胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma,ALCL)的患者相關。易位所導致的一鑲嵌酪胺酸激酶NPM-ALK(chimeric tyrosine kinase NPM-ALK)(核磷蛋白(nucleophosmin)的5’端融合至ALK的3’端)並構成致癌活性，增強了細胞增生及遷移、反抗細胞凋亡的訊號傳遞途徑以及透過多個連結於細胞內的訊號傳遞路徑包括Ras/ERK、JAK3/STAT3以及PI3K/AKT途徑使細胞骨架重組以改變細胞形狀。近來，另一個融合致癌基因EML4-ALK(echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase)(棘皮動物微小管關聯的相似蛋白4(5’echinoderm microtubule-associated protein-like 4)融合至ALK的3’端)被發現於肺腺癌中，且具有配位獨立(ligand-independent)及在活體外(in vitro)及活體內(in vivo)環境均具有致癌活性的活化酪胺酸激酶的特性。ALK激酶抑制劑在EML4-ALK的轉殖或異體移植的模式中顯示能抑制腫瘤，如此證實EML4-ALK在NSCLC中能作為一驅動突變及治療標的。多個EML4-ALK變異型已被指出主要盛行於高達7%的全數肺癌中的NSCLC案例。其他ALK的變異也於發炎肌纖維母細胞腫瘤(tropomyosin 4-anaplastic lymphoma kinase,TPM4-ALK)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(diffused large B-cell lymphoma,CLTC-ALK)以及最近發現的偶發性或家族性的神經母細胞瘤(sporadic and familial neuroblastoma)(獲得功能性的突變(gain-of-function mutations))中被發現。由於除了一些神經細胞以外，ALK並非廣泛表現在成熟組織中，同時也因幾個新的ALK選擇性的小分子抑制劑用於在臨床前及早期臨床試驗中，因此針對異常之ALK破壞其致癌傳導路徑將對於癌症之治療有著顯著影響。
    為說明ALK突變型在肺癌中功能上的轉變，本發明利用一系列的實驗使用ALK激酶活化、細胞增生、遷移以及細胞不貼壁生長(anchorage-independent growth,AIG)分析方法來評估6個造成胺基酸變異(non-synonymous)的ALK突變型。結合活體之老鼠異體移植致癌性分析方法，本發明發現此6個致癌ALK突變型之致癌能力。其中兩個較強的轉型ALK突變型係被選用來進一步分析當以ALK抑制劑進行治療，所阻斷之訊號傳遞及具有潛在治療的干預手段。本發明於幾株細胞株中均驗證，ALK激酶經磷酸化而活化在肺癌中是最常見的現象之一。致癌之ALK突變型在老鼠異體移植及系統性轉移模式(systemic metastasis models)中顯示會導致惡性腫瘤生成、轉移以及低存活率。以ALK抑制劑處理細胞或老鼠模式，不僅抑制了致癌性及其轉移，同時也延長了具有ALK突變型之老鼠的存活時間。 結果 ALK體細胞變異之鑑定及致癌力
    在增加微小衛星標記之密度以精確比對對偶基因失落(loss of heterozygosity,LOH)區域之後，發現微小衛星標記具有54.3%(AFM102yal,19/35)、69.4%(AFM220YH4,25/36)以及69.4%(AFM198wc5,25/36)的LOH頻率係分別位於肺癌基因EGFR、FHIT及ALK內。由於ALK坐落的2p23染色體區在比較基因體雜交(comparative genome hybridization,CGH)技術的分析中是染色體放大，因此推測ALK提供不對等的對偶基因放大，導致發生頻繁的LOH，因此用以進行體細胞點突變之檢測。雖然在11個肺癌細胞株中並未發現ALK突變型，但本發明在48對肺癌組織中發現分別於不同的蛋白質區域(domain)發生突變(MAM1區的S413N(第413個胺基酸自絲胺酸突變為天冬醯胺)突變型、MAM2區的V597A(第597個胺基酸自纈胺酸突變為丙胺酸)突變型、富含甘胺酸區(Glycine-rich domain)的G8811D(第8811個胺基酸自甘胺酸突變為天門冬胺酸)突變型、在激酶區(kinase domain)突變的Y1239H(第1239個胺基酸自酪胺酸突變為組胺酸)以及E1384K(第1384個胺基酸自穀胺酸突變為賴胺酸)突變型以及在區域外(non-domain area)突變的H694R(第694個胺基酸自組胺酸突變為精胺酸)突變型)的6個ALK突變型。以H1299細胞株表現6個ALK突變型並進行異體移植的腫瘤轉殖模式中，注射5週後，相較親代的H1299細胞株發展的的腫瘤重量，帶有野生型ALK過度表現的轉染細胞株所發展之腫瘤重量稍微增加，但帶有6突變型的轉染細胞株其所發展之腫瘤體積則是大幅度地增加及展現致癌的作用(如圖1A所示)。全部的體細胞ALK突變型係更進一步地藉由定序正反股之DNA序列(如圖5所示)，以及從6個個體中具突變型的肺癌組織切片，並利用聚合物放大免疫組織染色分析Y1604磷酸化之ALK所增加的蛋白表現量(如圖1B所示)確認ALK變異。 E694R及E1384K突變型展現具有激酶活性
    為更進一步探討突變型所調控之ALK激酶活性以及其下游之細胞訊號傳遞，蛋白質功能區域外的H694R及在激酶區的E1384K突變型在H1299細胞株及老鼠胚胎NIH3T3纖維母細胞中穩定地表現來分別驗證在限制及不限制肺癌細胞背景的情況下突變型本身所具有之致癌作用。利用免疫沉澱及西方墨點法分析方法，可知轉染野生型ALK的H1299轉染細胞株(transfectant)及NIH3T3轉染細胞株中Y1604及所有的酪胺酸之磷酸化均有稍微增加的情形，但轉染H694R及E1384K突變型的細胞株中則顯著強化酪胺酸磷酸化的情況(如圖2A)。利用活體外激酶分析方法更進一步驗證H694R及E1384K突變型強化的酪胺酸激酶活性(如圖6所示)。為進一步說明訊號傳遞路徑的改變，檢視ALK下游的受動器(effectors)包括STAT3、Akt及ERK。結果與激酶活性增加之結果一樣，相較於野生型及負控制組(mock control)、H694R及E1384K突變型強烈地使STAT3、Akt及ERK蛋白發生磷酸化(如圖2A所示)。為進一步了解突變型調控之ALK激酶活性的分子機制，因此檢視H694R及E1384K突變型的蛋白穩定性及次細胞中的位置(subcellular localization)。結果顯示，H694R及E1384K突變型的蛋白及野生型的ALK蛋白均有相同的特性，其半衰期均約為3.5小時，且均位於細胞質中(如圖7所示)。總體而言，依據本發明之實驗結果可知，H694R及E1384K突變型在H1299及NIH3T3細胞株中本身自體活化(constitutively activate)ALK激酶活性及其下游之STAT3、Akt及ERK訊息傳遞路徑。 表現增加的Y1604磷酸化之ALK作為肺癌之診斷標記
    ALK突變型證實在細胞模式以及患者組織中能增加Y1604磷酸化之ALK表現增加以及激酶活性，則欲探討的是，內生性ALK激酶活性是否亦在肺癌細胞株中及臨床樣本中被活化。雖然已成功的將患者組織切片以聚合物放大免疫組織化學染色分析Y1604磷酸化之ALK表現，然而卻無法在11株肺癌細胞株中利用西方墨點法以3個不同來源的抗體檢測到整體內生性的ALK。相反地，則是輕易地在11株肺癌細胞株中證實Y1604被高度磷酸化(hyperphosphorylation)的ALK之存在(如圖2B所示)。
    接著檢視肺癌臨床的樣本中活化的ALK激酶表現，利用肺癌組織陣列分析(lung cancer tissue arrays)37個正常肺部組織(於圖2C中表示為「正常」)及263個肺癌組織中Y1604被磷酸化的ALK之IHC染色，其中肺癌組織係包括13個小細胞肺癌(於圖2C中表示為SCLC)、55個腺癌(於圖2C中表示為Ad)、126個表皮細胞瘤(於圖2C中表示為SQ)以及69個具有肺癌之其他亞型(於圖2C中表示為「其他」)。染色的強度係經由兩個病理學家評估並依據染色強度範圍0~4給予計分(如圖8所示)。不論肺癌之亞型及時期，所有腫瘤組織顯示相較於正常的肺部組織具有極強的Y1604磷酸化之ALK表現強度，且腫瘤組織與正常肺部組織之平均計分強度(average scoring intensity)係分別為2.9684±0.6852及0.554±0.3340(p＜0.001)。而Y1604磷酸化之ALK抗體偵測肺癌樣本之靈敏度，於IHC計分強度為大於1及大於2時分別為99.6%及92.8%。同一肺癌樣本也經由IHC檢測整體ALK表現。不論肺癌之亞型及時期，當IHC計分強度分別為大於1及大於2時，所測得之肺癌之靈敏度則係分別為61.59%(162/263)及18.3%(48/263)。IHC分析結果經統計分析發現，Y1604磷酸化之ALK表現與整體ALK之表現在肺癌樣本中並無相關性(p=0.4449，如表2所示)。且結果顯示，ALK激酶之活化不僅在腺癌中扮演著重要角色，同時也在肺癌之其他亞型中扮演著重要角色。Y1604磷酸化之ALK蛋白表現增加可以於肺癌發展過程中的初期步驟，且有潛力成為一有效的診斷肺癌之標記(如圖2C所示)。 H694R及E1384突變型於老鼠異體移植模式之致癌訊號傳遞
    為驗證獲得ALK突變型之詳細的致癌作用，係透過H694R及E1384K突變型轉染至H1299及NIH3T3細胞株中進行活體外(in vitro)及活體內(in vivo)之分析所誘導之致癌機制。結果顯示，相較於負控制組(mock control)野生型ALK表現只稍微增強了致癌作用，特別係在較長的時間點之分析(如圖3A~圖3C)。相反地，H694R及E1384K突變型相較於野生型ALK之表現係大幅度地增加其致癌之作用。為更進一步驗證ALK突變型誘導致癌活性係因激酶活性之增加，因此本發明針對從異體移植老鼠模式中取得腫瘤切片，並利用抗體進行IHC染色分析用以偵測活化的ALK激酶及下游之調節者(mediators)STAT3及Akt。結果一致地顯示，當利用ALK之磷酸化來偵測ALK之活性時，含有野生型之ALK之樣本中，STAT3及Akt之磷酸化僅稍微增加，而帶有H694R及E1384K突變型之異體移植腫瘤切片中，STAT3及Akt之磷酸化則有顯著增加的情形(如圖3D所示)。因此，這些結果顯示，被ALK突變型H694R及E1384K所驅動之腫瘤進展係增加激酶活性及增進下游致癌之訊號傳遞。 H694R及E1384K突變型對於ALK抑制劑係敏感的
    為研究小分子的ALK激酶抑制劑是否能用於抑制ALK突變型所調控之致癌性，接下來將驗證野生型、H694R及E1384K突變型ALK蛋白對於近來發現具有抑制ALK激酶活性之抑制劑WHI-P154之靈敏度。結果顯示，經WHI-P154處理後，細胞生長情形以及Y1604磷酸化之ALK表現相對於野生型及突變型的ALK轉染細胞株均呈現劑量依賴(dose-dependent)之抑制關係。然而，突變型H694R及E1384K具有較高的抑制敏感度(inhibitory sensitivity)(如圖4A及圖4B所示)。WHI-P154對於ALK活性之抑制作用也於H1299細胞株中分別以細胞不貼壁生長分析方法(anchorage-independent growth,AIG)及細胞遷移分析進行偵測。結果也顯示，相較於以DMSO做為控制組，WHI-P154處理後，軟性瓊膠群落生長及細胞遷移分析中，導致突變型轉染細胞株全然抑制(如圖4A所示)。WHI-P154對H694R及E1384K突變型轉染細胞株之最大半量抑制濃度(half-maximal inhibitory concentration,IC50)相較野生型ALK之轉染細胞株低2.28~2.86倍，兩個ALK突變型對於ALK抑制劑WHI-P154比野生型之ALK具有較高之抑制反應(如表3所示)。結果也證實，致癌ALK突變型可作為一種用於治療肺腺癌之具有潛力的治療標的。 WHI-P154抑制H694R及E1384K突變型調控之致癌機制及轉移及延長具有突變型之老鼠壽命
    為進一步評估抑制ALK突變型所構成之激酶活性的治療潛力，接下來於具有H694R及E1384K之H1299細胞株經由皮下注射到裸鼠(nude mice)之異體移植模式及尾部靜脈注射肺癌轉移模式中進行檢視WHI-P154於活體內(in vivo)之療效。在模仿人類癌症模式中，一旦異體移植之腫瘤增加至約30~50 mm3的腫瘤體積時，即將老鼠任意分成兩組並分別每天處理WHI-P154及DMSO控制組。以WHI-P154處理的具有ALK突變型的老鼠，相較控制組老鼠，其腫瘤之生長顯著地減緩(如圖4C所示)。為更進一步驗證WHI-P154抑制異體移植老鼠之腫瘤生長係因為ALK活性之降低所導致，異體移植老鼠進行腫瘤切片，並利用IHC方法針對Y1604磷酸化之ALK進行染色檢測。其結果與ALK突變型之激酶依賴(kinase-dependent)癌化活性一致，相較DMSO控制組，具H694R及E1384K突變型經WHI-P154之腫瘤切片所測得之Y1604磷酸酸化之ALK表現明顯降低許多(如圖9所示)。總括來說，在體內的異體移植研究中指出，ALK抑制劑WHI-P154可作為一種具有潛力的治療藥劑，治療由ALK突變型所引發之肺部癌化。
    在肺癌轉移模式中，H694R及E1384K突變型與表現GFP質體進行共同轉染至H1299細胞株中，此可用以做為在靜脈注射後用以檢測系統性癌轉移(systemic metastasis)。從結果中可知，H694R及E1384K兩突變型顯現具有較野生型ALK及負控制組細胞株強的轉移潛能(如圖4D所示)。以WHI-P154處理帶有突變型的老鼠能明顯抑制其肺癌轉移(如圖4D所示)。更重要的是，H694R及E1384K兩突變型引發肺癌轉移之老鼠具有較低存活率(如圖4E所示)。E1384K突變型的強烈轉移趨勢所導致老鼠的低存活率相較於野生型及以WHI-P154處理的具突變型老鼠在統計上具有顯著意義(P=0.0246)。相反地，WHI-P154處理具有H694R及E1384K兩突變型之老鼠後不僅抑制其肺癌轉移，也能達到與控制組老鼠之存活時間相同之效果(如圖4E所示)。總結上述，ALK突變能構成活化ALK下游之致癌訊號傳遞導致肺腺癌之致癌機制。以ALK突變型為作用標的給予ALK抑制劑WHI-P154，不僅抑制致癌性及癌症轉移同時也延長了具有突變型老鼠之存活時間。 討論
    從本發明之結果中證實，ALK體細胞變異包括Y1604磷酸化之ALK異常增加及其點突變，扮演了肺癌致癌發展的重要角色。長期的過度表現Y1604磷酸化之ALK能適度地活化下游的致癌訊號傳遞路徑以調節肺癌之致癌作用。ALK點突變所導致結構性激酶活性而強化下游Akt、STAT3及ERK訊號傳遞路徑以驅動腫瘤的發展。本發明之結果指出ALK激酶可以透過異質傳遞路徑而活化，以增加Y1604之磷酸化，構成肺癌致癌性之早期以及後續整個癌症之進程。儘管如此，ALK蛋白之Y1604被磷酸化及發生點突變有潛力分別作為肺癌之診斷的生物標記及治療標的。
    值得注意的是，相較先前文獻中以西方墨點法及IHC分析內生性之ALK蛋白表現的困難且只能於肺部組織中測得。本發明之結果可同時於肺癌組織及細胞株中以西方墨點法及IHC分析測得內生性之ALK蛋白表現，且61.59%(162/263)組織微陣列分析(tissue microarrays)的肺癌樣本利用IHC分析能檢測到全部之ALK表現。另外，於肺癌細胞株及組織中對於Y1604磷酸化之ALK蛋白之偵測結果指出，透過Y1604的磷酸化使得ALK激酶的活化確實於肺癌中發生。對於檢測肺癌中內生性的ALK及Y1604被磷酸化之ALK所增加之靈敏度，可能是因為Y1604磷酸化之ALK異常調升、使用來自於不同來源的抗體以及應用的是聚合物型訊號放大系統(polymer-based signal amplification system)而非傳統IHC檢測的方法所致。除調控酪胺酸激酶活化的ALK點突變外，後續發現的增加致癌Y1604磷酸化之ALK蛋白表現的其他機制以及其他交互作用之致癌傳遞路徑皆能使ALK變異成為新的肺癌治療標的。
    相較野生型ALK、H694R及E1384K突變型ALK對於專一性之shRNA抑制(knockdown)及ALK蛋白抑制劑WHI-P154在功能性分析時靈敏度的增加更說明了，後天性體細胞突變構成ALK激酶活性對於肺癌細胞具有加乘作用而成為變成惡性腫瘤之趨勢，因此適於作為治療肺腺癌之標的(如圖4A至圖4D)。本發明另外於系統性轉移的裸鼠系統為模式，檢視當H694R及E1384K突變型以ALK蛋白抑制劑WHI-P154處理前後期轉移趨勢及存活率上的總體優勢。雖然WHI-P154抑制癌症轉移之分子機制尚不明確，但當WHI-P154處理後，帶有H694R及E1384K突變型之老鼠的存活時間延長說明了ALK抑制劑於肺癌中的治療效益。
    為進一步詳細描述關於ALK體細胞變異於增進肺癌診斷的重要性以及在患者的治療效益，將來需再建立幾項工作。首先，需密集的檢測較大群人及暴露在各種潛在危險因子的不同族群具有之經磷酸化活化之ALK及其他ALK突變型。其次，致力於探討ALK的異常磷酸化及突變型在蛋白質構型改變、酪胺酸激酶之增強以及所調控的下游致癌之訊號傳遞路徑上所造成的致病機轉。這些結果將不僅有助於了解對於在腫瘤形成中ALK訊號傳遞的異質特性，同時也助於發生ALK突變的肺癌患者在臨床上的處理。最後，由於ALK蛋白抑制劑WHI-P154在老鼠肺癌模式中抑制腫瘤進程及延長其存活時間，因此本發明之結果清楚說明了ALK蛋白抑制劑作為治療肺癌之極有潛力的治療工具，且須加速開發供個體化肺癌治療的新ALK抑制劑。再者，對於具有兩種其他突變基因(如EGFR及KRAS)的肺癌患者可趨於發展結合兩種臨床上核准藥物的新治療法，以因應現今肺癌的治療。 材料及方法 抗體及試劑
    西方墨點法偵測時，係以專一性之抗HA抗體(Covance)、抗磷酸化酪胺酸(phospho-tyrosine)抗體(4G10;Upstate Biotechnology)、抗STAT3抗體(sc-482;Santa Cruz)以及抗α-微管蛋白(α-tubulin)抗體(DM1A;NeoMarkers)探測。抗磷酸化ALK(phospho-ALK)(於1604之酪胺酸上具有磷酸化)抗體、抗磷酸化Akt(於427之絲胺酸上具有磷酸化)、抗磷酸化STAT3(於705之酪胺酸具有磷酸化)抗體、抗磷酸化ERK(於202之蘇胺酸/204之酪胺酸上具有磷酸化)抗體、抗Akt抗體及抗ERK抗體均係購自Cell Signaling。於IHC偵測時，組織切片以抗磷酸化ALK(pY1604;Epitomics)、抗ALK(4204-1;Epitomics)、(Tyr705,D3A7;Cell Signaling)抗磷酸化STAT3以及抗磷酸化Akt(Ser473,736E11;Cell Signaling)專一性抗體進行染色。而ALK蛋白抑制劑WHI-P154係購自Calbiochem。關於ALK基因之外顯子(exon)及內含子(intron)之邊界係參照Ensembl database上的註記，且依其設計之引子係如表1所列。
    ALK之質體構築及細胞轉染
    ALK野生型之全長cDNA序列係以限制切位(restriction sites)Hind III及Not I接合至pCDNA3.0載體。所有的ALK突變型係取自於pCDNA3.0-ALK-野生型全長構築質體(pCDNA3.0-ALK-wild type full-length construct)作為模板，並利用定點突變技術(site-directed mutagenesis)合成。H1299及NIH3T3細胞株以Dulbecco’s Modified Eagle培養基(DMEM)添加10%胎牛血清(FBS)及鏈黴素(streptomycin)培養。各表現質體經由Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染至H1299及NIH3T3細胞株，並以G418篩選，以建立表現ALK縱合表現型細胞株(mixed transfectants)。 西方墨點法及免疫共沉澱分析
    細胞係以RIPA緩衝溶液(200 mM Tris,150 mM NaCl,1 mM EDTA,1% NP40,1 mM PMSF,1 mM DTT)溶解，RIPA緩衝溶液同時添加有1倍磷酸酶抑制劑雞尾酒組合II(phosphatase inhibitor cocktail set II,Calbiochem)以及1倍的磷酸酶抑制劑雞尾酒(Roche)。蛋白質的濃度係以BCA蛋白分析套組(Pierce Chemical)分析。取等量的細胞溶解液進行SDS-PAGE分析，接著轉換至NC膜上，並以專一性抗體進行蛋白質之檢測。在免疫共沉澱之分析中，等量的細胞溶解液係先與抗HA抗體(anti-HA antibody)培養1小時，再與蛋白質A/G反應至隔夜。免疫沉澱粒子(immunoprecipitated-beads)經清洗後用於西方墨點法中以專一性抗體分析。 免疫組織染色
    人類肺癌組織陣列分析中係包括從Pantomics公司(Luc961,Luc962,Luc1501,Luc1502以及Luc1503)獲得的37個正常的人類肺部組織以及263個人類肺癌組織切片進行脫蠟，從異體移植的裸鼠取得後冷凍的腫瘤切片以3%甲醛(formaldehyde)溶液固定。所有的切片再以3%過氧化氫(H2O2)緩衝溶液處理30分鐘，使內生性之過氧化氫酶失去活性，再以0.01 M的檸檬酸鈉(sodium citrate)緩衝溶液進行抗原修復(antigen retrieval)。在以10%正常的山羊血清阻斷後，這些切片與專一性抗體於4℃下反應至隔夜。接著，這些切片再與Super Picture HRP聚合物接合二級抗體(Zymed Laboratories)，再以DAB呈色劑(DAB chromagen,Zymed Laboratories)呈色。而這些切片也可以以蘇木素(Hematoxylin,DAKO)染色。 細胞增生分析
    細胞生長分析中，在96-孔盤每個孔洞接種1×103顆細胞。經不同培養時間之後，於每個孔洞中加入10 μl的WST-1試劑(Roche Diagnostics)，於37℃下反應50分鐘。最後偵測在450nm波長之吸光質。 細胞不貼壁生長分析
    取總數約2×104顆H1299或NIH3T3經轉染之細胞株混合最終濃度為0.3%的瓊脂糖(agarose)，並平鋪於含有0.5%瓊脂糖的60 mm瓊脂盤。這些細胞再以5% CO2、37℃的培養箱中培養一個月。瓊脂盤於室溫下脫水後，以0.3%結晶紫(crystal violet)染色觀察群落。並利用Image-pro plus分析軟體計數群落數。 Boyden Chamber分析
    細胞遷移之能力係以Boyden Chamber分析方法進行檢測。簡單來說，H1299或NIH3T3經轉染之細胞株取約2×104顆分別接種於僅含有350 μl之DMEM培養基的細胞遷移杯(cell migration insert,BD Biosciences)，接著再把遷移杯置入含有750 μl之完全DMEM培養基(complete DMEM medium)添加10%胎牛血清(FBS)的24孔盤中。經24小時培養後遷移的細胞係以100%甲醇(methanol)固定，以Giemsa’s溶液(Merck)染色。遷移的細胞數係以Image-pro plus analysis program計數。 活體內異體移植腫瘤生成分析
    動物操作流程係由機構動物安全委員會(Institutional Animal Safety Committee)所認可。轉染野生型或突變型ALK之H1299細胞株1×106顆與人工基底膜(matrigel,BD)混合，再注射到4週大BALB/c NU老鼠之右側腹腔中。在WHI-P154處理實驗中，當腫瘤之平均體積達到20~50 mm3時，將老鼠任意分為兩組，每天於靜脈注射注射DMSO或WHI-P154(每公斤體重的老鼠每天注射1 mg)。每週計算腫瘤體積，並根據以下公式統計：體積=長度×寬度2×0.52(volume=length×width2×0.52)。 活體內腫瘤轉移分析
    為檢視腫瘤於體內轉移之能力，表現ALK野生型或突變型的H1299細胞株係又轉染綠螢光-慢病毒(GFP-lentivirus)以產生具有綠螢光標定之細胞株。取約2×106顆細胞並注射至裸鼠尾部靜脈，以觀測肺部腫瘤轉移。為研究使用ALK蛋白抑制劑對於腫瘤的抑制效果，裸鼠於接種細胞後的14天後，裸鼠每天以靜脈注射WHI-P154(每公斤體重的老鼠每天注射1 mg)。每天記錄老鼠之存活率，並於105天之後犧牲所有剩餘的老鼠。而已GFP標定之H1299轉染細胞株係以螢光立體顯微鏡觀察。 統計分析
    所有的數據均以平均值之標準誤差呈現(平均值±s.e.m)。為比較不同組別之間之數據，以Student’s t檢測決定統計上的顯著差異。於Y1604磷酸化之ALK以及總ALK於IHC分析中之表現關係，係利用SAS的Pearson’s相關係數(Pearson’s correlation coefficient)進行統計。於存活率的分析當中，用於比較其他各組別中的野生型的成對比較(paired comparison)，於SAS系統中以的以多重比較(multiple-comparison)調整P值(P-values)。 附加之材料方法 活體外之激酶分析
    轉染ALK轉染細胞株的體外之激酶分析係以蛋白質酪胺酸激酶分析套組(protein tyrosine kinase assay kit,Sigma)並依照其操作手冊進行檢測。檢而言之，細胞係以溶解緩衝溶液溶解。當蛋白質以BCA定量後，等量之細胞溶解液係分別加至覆蓋有聚-穀胺酸-酪胺酸(poly-Glu-Tyr)受質的孔洞中。培養30分鐘後，再以過氧化氫酶接合之抗磷酸酪胺酸抗體(peroxidase-conjugated anti-phosphotyrosine antibody)反應。與OPD過氧化氫酶受質(OPD peroxidase substrate)培養後，以多孔盤ELISA讀值機(multiwell plate ELISA reader)偵測於492 nm的波長吸光值。 shRNA及慢病毒感染
    用於靜默ALK基因之shRNA係自台灣之National RNAi Core Facility，以pLKO.1慢病毒(pLKO.1 lentiviral)表現具有構築目標序列CTGGTCATAGCTCCTTGGAAT之載體。以靜默螢光酶(luciferase,luc)之shRNA做為控制組。對於慢病毒之產生，293T細胞株係共轉染表現載體、包裝質體(packaging plasmids)pMD.G以及pCMV△R8.91之慢病毒。轉染4天後，收集並過濾含有病毒之培養基。轉染ALK之H1299轉染細胞株係於含有聚凝胺(polybrene)之含病毒培養基中進行感染。再以西方墨點法評估shRNA之抑制(knockdown)效率。
    以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。 參考文獻
    1.　WHO. World Health Organization. "Cancer". http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/. Retrieved 2010-03-03.
    2.　Ladanyi,M. & Pao,W. Lung adenocarcinoma: guiding EGFR-targeted therapy and beyond. Mod Pathol 21 Suppl 2,S16-22(2008).
    3.　Sun,S.,Schiller,J.H.,Spinola,M. & Minna,J.D. New molecularly targeted therapies for lung cancer. J Clin Invest 117,2740-2750(2007).
    4.　Herbst,R.S.,Heymach,J.V. & Lippman,S.M. Lung cancer. N Engl J Med 359,1367-1380(2008).
    5.　Sun,S.,Schiller,J.H. & Gazdar,A.F. Lung cancer in never smokers--a different disease. Nat Rev Cancer 7,778-790(2007).
    6.　Subramanian,J. & Govindan,R. Molecular genetics of lung cancer in people who have never smoked. Lancet Oncol 9,676-682(2008).
    7.　Jemal,A.,et al. Cancer statistics,2009. CA Cancer J Clin 59,225-249(2009).
    8.　Fischer,P.,et al. A Ki-1(CD30)-positive human cell line(Karpas 299) established from a high-grade non-Hodgkin's lymphoma,showing a 2;5 translocation and rearrangement of the T-cell receptor beta-chain gene. Blood 72,234-240(1988).
    9.　Morris,S.W.,et al. Fusion of a kinase gene,ALK,to a nucleolar protein gene,NPM,in non-Hodgkin's lymphoma. Science 263,1281-1284(1994).
    10. Chiarle,R.,Voena,C.,Ambrogio,C.,Piva,R. & Inghirami,G. The anaplastic lymphoma kinase in the pathogenesis of cancer. Nat Rev Cancer 8,11-23(2008).
    11. Soda,M.,et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature 448,561-566(2007).
    12. Soda,M.,et al. A mouse model for EML4-ALK-positive lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 105,19893-19897(2008).
    13. Horn,L. & Pao,W. EML4-ALK: honing in on a new target in non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 27,4232-4235(2009).
    14. Mosse,Y.P.,et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature 455,930-935(2008).
    15. Janoueix-Lerosey,I.,et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature 455,967-970(2008).
    16. Chen,Y.,et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature 455,971-974(2008).
    17. George,R.E.,et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature 455,975-978(2008).
    18. Palmer,R.H.,Vernersson,E.,Grabbe,C. & Hallberg,B. Anaplastic lymphoma kinase: signalling in development and disease. Biochem J 420,345-361(2009).
    19. Balsara,B.R. & Testa,J.R. Chromosomal imbalances in human lung cancer. Oncogene 21,6877-6883(2002).
    20. Tseng,R.C.,et al. Genomewide loss of heterozygosity and its clinical associations in non small cell lung cancer. Int J Cancer 117,241-247(2005).
    21. Weir,B.A.,et al. Characterizing the cancer genome in lung adenocarcinoma. Nature 450,893-898(2007).
    22. Bai,R.Y.,Dieter,P.,Peschel,C.,Morris,S.W. & Duyster,J. Nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase of large-cell anaplastic lymphoma is a constitutively active tyrosine kinase that utilizes phospholipase C-gamma to mediate its mitogenicity. Mol Cell Biol 18,6951-6961(1998).
    23. Amin,H.M.,et al. Inhibition of JAK3 induces apoptosis and decreases anaplastic lymphoma kinase activity in anaplastic large cell lymphoma. Oncogene 22,5399-5407(2003).
    24. Boland,J.M.,et al. Anaplastic lymphoma kinase immunoreactivity correlates with ALK gene rearrangement and transcriptional up-regulation in non-small cell lung carcinomas. Hum Pathol 40,1152-1158(2009).
    25. Martelli,M.P.,et al. EML4-ALK rearrangement in non-small cell lung cancer and non-tumor lung tissues. Am J Pathol 174,661-670(2009).
    圖1為6個ALK突變型之致癌作用，(A)為說明ALK蛋白具有兩個meprin/A5-protein/PTPmu(MAM)區、一個LDL Receptor class A(LDLA)區、一個富含甘胺酸區(Glycine-rich region)、一個跨膜區(transmembrane domain,TM)以及一個細胞質酪胺酸激酶(cytoplasmic tyrosine kinase,TK)區，經鑑定之ALK突變型係表現於H1299細胞株中，以與轉染負控制組(mock)比較在異體移植腫瘤生成分析中的致癌力，*以及**係分別表示P<0.05以及P<0.01下之顯著差異，(B)為以免疫組織色分析具有突變型之肺癌組織切片中所表現的Y1604磷酸化之ALK，比例尺表示50 μm；
    圖2為ALK體細胞突變以及於肺癌中受磷酸化活化之致癌訊號，(A)為ALK野生型(WT)及ALK突變型轉染至H1299細胞株及NIH3T3細胞株之免疫沉澱法(IP)及西方墨點法分析結果，免疫沉澱係以抗HA抗體進行，並供後續西方墨點法分析Y1604磷酸化之ALK及酪胺酸被磷酸化(4G10)之ALK總量，另外，分析之下游訊號調節者包括STAT3、Akt以及ERK的磷酸化的西方墨點法中，係包括由抗HA抗體進行偵測之ALK表現控制組、作為樣本加入控制組織微管蛋白(tubulin)以及作為總蛋白量控制組的STAT3、Akt以及ERK蛋白，(B)為利用西方墨點法檢測於11株肺癌細胞株中Y1604磷酸化之ALK表現量，(C)為經IHC分析並以0到4的計分強度顯示於正常肺部組織及肺癌樣本中Y1604磷酸化之ALK及總ALK蛋白之表現分布，組織陣列中所含的常見肺癌(總案例為263件)亞型係包括小細胞肺癌(SCLC)、腺癌(Ad)、上皮細胞癌(SQ)以及其他亞型，圖中紅線表示平均值±s.e.m.之強度，**表示當P<0.001時統計上的顯著差異；
    圖3為ALK突變型H694R及E1384K之致癌活性，在H1299及NIH3T3細胞株中所表現的ALK野生型(WT)及突變型的致癌特性係以細胞增生(如圖A)、AIG(如圖B，上欄)以及細胞遷移能力(如圖B，下欄)表示，(C)為異體移植帶有ALK之H1299轉染細胞株到裸鼠中腫瘤體積於皮下接種後5天之影像係如圖所示(上欄)，數據係以腫瘤生長曲線(下欄)所表示，(D)為自野生型、H694R以及E1384K突變型ALK轉染的H1299轉染細胞株進行異體移植後去得知切片中，係藉由IHC分析ALK、STAT3以及Akt之磷酸化以檢測由活化的ALK之下游致癌訊號，比例尺係表示50 μm，數據係以平均值±s.e.m表示，*及**分別表示當P<0.01以及P<0.001時的顯著差異；
    圖4A至圖4E為ALK抑制劑對於H694R及E1384K突變型所調控之致癌性的治療效果，(A)為比較轉染野生型(WT)、H694R以及E1384K突變型ALK之H1299轉染細胞株對於WHI-P154的抑制效果係包括經由WST-1分析細胞生長係呈劑量依賴關係的抑制作用(上欄)、AIG分析中顯示的群落數(中欄)以及細胞遷移的細胞遷移數(底欄)，(B)為經由西方墨點法(上欄)分析及其定量強度(底欄)證明，以WHI-P154處理野生型、H694R以及E1384K突變型ALK之H1299轉染細胞株，Y1604磷酸化之ALK係呈現劑量依賴抑制關係，(C)為關於異體移植裸鼠模式中由H694R以及E1384K突變型ALK所引發之致癌性經由WHI-P154(1 mg/kg)處理後腫瘤的抑制效果係如圖片(上欄)及腫瘤生長曲線(下欄)所示，帶有GFP的野生型、H694R以及E1384K突變型ALK之H1299轉染細胞株，以WHI-P154處理或不經WHI-P154處理之轉染細胞株注射到老鼠尾部靜脈後62天，對系統肺炎轉移之作用係以肉眼以及螢光觀察肺部影像(D)並分析存活率(E)；
    圖5為六個ALK突變型之DNA序列電子分析影像圖(electropherograms)，經由正反股序列確認，比對肺腺癌之對照之腫瘤及腫瘤旁之正常組織之定序來呈現突變型之快照影像；
    圖6為ALK突變型H694R及E1384K之體外之激酶活性分析係透過ELISA反應偵測於492 nm下的吸光值，數據係以平均值±s.e.m，**表示當P<0.001時統計上的顯著差異；
    圖7為H694R及E1384K突變型ALK之蛋白穩定性及次細胞位置，(A)具有HA標記的野生型(WT)、H694R及E1384K突變型ALK蛋白於H1299細胞株中的表現係以不同的環己烷醯胺(cycloheximide,Chx)處理時間及以抗HA抗體進行西方墨點法分析(左欄)，正號代表係加入防止蛋白質降解之MG132，剩餘蛋白質之定量係如右欄所示，ALK蛋白之半衰期係以虛線表示，(B)為ALK轉染細胞株係以4%甲醛固定，並以0.5% Triton X-100/PBS打洞，TRITC-HA標定的ALK蛋白係利用共軛焦顯微鏡及雷射掃描顯微鏡觀察，細胞核係以Hoechst染劑椱染；
    圖8為在組織陣列分析中，肺癌切片中Y1604磷酸化之ALK蛋白(A)及總ALK蛋白(B)依IHC計分強度0~4排列之影像圖；
    圖9為在異體移植腫瘤切片中，WHI-P154對於Y1604磷酸化之ALK蛋白表現之抑制作用，控制組係以DMSO處理；以及
    圖10為轉染野生型(WT)、H694R及E1384K突變型之ALK之H1299轉染細胞株，以shRNA抑制後對於蛋白表現及細胞增生之影響，(A)H1299轉染細胞株以西方墨點法分析ALK蛋白之抑制效率(knockdown efficiency)，其中微管蛋白係作為蛋白加入量(protein loading)之控制組，(B)轉染野生型、H694R及E1384K突變型ALK之H1299轉染細胞株於慢病毒感染4天後，相較於螢光酶-shRNA(luc-shRNA)控制組，ALK-shRNA之生長抑制作用。
    权利要求:
    Claims (31)
    [1] 一種用於診斷肺癌的方法，包括：檢測源於肺腺癌患者之異生性淋巴瘤激酶突變型，並透過分析方法檢測致癌活性。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該異生性淋巴瘤激酶突變型係為異生性淋巴瘤激酶基胺基酸序列之第413個胺基酸自絲胺酸突變為天冬醯胺。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該異生性淋巴瘤激酶突變型係為異生性淋巴瘤激酶胺基酸序列之第597個胺基酸自纈胺酸突變為丙胺酸。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該異生性淋巴瘤激酶突變型係為異生性淋巴瘤激酶胺基酸序列之第694個胺基酸自組胺酸突變為精胺酸。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該異生性淋巴瘤激酶突變型係為異生性淋巴瘤激酶胺基酸序列第8811個胺基酸自甘胺酸突變為天門冬胺酸。
    [6] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該異生性淋巴瘤激酶突變型係為異生性淋巴瘤激酶胺基酸序列第1239個胺基酸自酪胺酸突變為組胺酸。
    [7] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該異生性淋巴瘤激酶突變型係為異生性淋巴瘤激酶胺基酸序列第1384個胺基酸自穀胺酸突變為賴胺酸。
    [8] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該檢測步驟係檢測胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶表現。
    [9] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該檢測步驟係檢測胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶表現量之增加。
    [10] 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該檢測胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶表現係透過免疫組織化學染色偵測。
    [11] 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中正常的肺部組織之該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶的平均計分強度係為0.554±0.3340，而肺癌組織之該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶的平均計分強度係為2.9684±0.6852。
    [12] 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中當免疫組織化學染色之強度大於2時，該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶抗體之靈敏度及專一性係分別為92.8%及100%。
    [13] 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中當免疫組織化學染色之強度大於1時，該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶抗體之靈敏度及專一性係分別為99.6%及89.2%。
    [14] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該分析方法係用於造成胺基酸變異之異生性淋巴瘤激酶突變型之檢測，包括異生性淋巴瘤激酶之激酶活性、細胞增生、細胞遷移以及細胞不貼壁生長之檢測。
    [15] 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該分析方法係包括老鼠活體內異體移植致癌性分析。
    [16] 一種用於治療肺癌之方法，包括：檢測源於肺腺癌患者之異生性淋巴瘤激酶突變型；以及以一異生性淋巴瘤激酶抑制劑投藥，以抑制由異生性淋巴瘤激酶突變型所調控之致癌性。
    [17] 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該異生性淋巴瘤激酶抑制劑係選自WHI-P154、TAE684以及Crizotinib所組成之群組。
    [18] 一種用於診斷肺癌之方法，包括：檢測肺腺癌患者之異生性淋巴瘤激酶突變型；以及透過分析方法檢測致癌活性，其中，該檢測之肺腺癌患者之異生性淋巴瘤激酶突變型係為表現調升之胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶，且該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶之表現係以一免疫組織化學染色檢測。
    [19] 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中正常的肺部組織之該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶的平均計分強度係為0.554±0.3340，而肺癌組織之該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶的平均計分強度係為2.9684±0.6852。
    [20] 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中當免疫組織化學染色之強度大於2時，該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶抗體之靈敏度及專一性係分別為92.8%及100%。
    [21] 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中當免疫組織化學染色之強度大於1時，該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶抗體之靈敏度及專一性係分別為99.6%及89.2%。
    [22] 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該分析方法係用於造成胺基酸變異之異生性淋巴瘤激酶突變型之檢測，包括異生性淋巴瘤激酶之激酶活性、細胞增生、細胞遷移以及細胞不貼壁生長之檢測。
    [23] 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該分析方法係包括老鼠活體內異體移植致癌性分析。
    [24] 一種用於治療肺癌之方法，包括：檢測肺腺癌患者之異生性淋巴瘤激酶突變型；以及以一異生性淋巴瘤激酶抑制劑投藥，以抑制由異生性淋巴瘤激酶突變型所調控之致癌性，其中該檢測之肺腺癌患者之異生性淋巴瘤激酶突變型係為表現調升之胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶，且該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶之表現係以一免疫組織化學染色檢測，該異生性淋巴瘤激酶抑制劑係選自WHI-P154、TAE684以及Crizotinib所組成之群組。
    [25] 如申請專利範圍第24項所述之方法，其中正常的肺部組織之該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶的平均計分強度係為0.554±0.3340，而肺癌組織之該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶的平均計分強度係為2.9684±0.6852。
    [26] 如申請專利範圍第24項所述之方法，其中當免疫組織化學染色之強度大於2時，該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶抗體之靈敏度及專一性係分別為92.8%及100%。
    [27] 如申請專利範圍第24項所述之方法，其中當免疫組織化學染色之強度大於1時，該胺基酸序列第1604位置之酪胺酸具有磷酸化之異生性淋巴瘤激酶抗體之靈敏度及專一性係分別為99.6%及89.2%。
    [28] 如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該分析方法係用於胺基酸變異之異生性淋巴瘤激酶突變型之檢測，包括異生性淋巴瘤激酶之激酶活性、細胞增生、細胞遷移以及細胞不貼壁生長之檢測。
    [29] 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該分析方法係包括老鼠活體內異體移植致癌性分析方法。
    [30] 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該異生性淋巴瘤激酶抑制劑係為WHI-P154。
    [31] 如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該異生性淋巴瘤激酶抑制劑係為WHI-P154。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US20120129869A1|2012-05-24|
    TWI608235B|2017-12-11|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    US20160122825A1|2012-06-26|2016-05-05|Board Of Regents, The University Of Texas System|Efficient functional genomics platform|
    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US41285810P| true| 2010-11-12|2010-11-12||
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